Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 4407 (2023) Citer cet article
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L'insuffisance rénale aiguë (AKI) est un facteur de risque important d'insuffisance rénale chronique (IRC), mais les mécanismes sous-jacents de l'échec de la réparation des tubules et de la transition AKI-IRC ne sont pas complètement compris. Dans cette étude, nous avions pour objectif le suivi dynamique des lésions tubulaires et du remodelage afin de comprendre si les lésions focales provoquées par l'AKI pouvaient se propager dans le temps. Nous présentons ici un modèle d’AKI, dans lequel nous avons rendu seulement la moitié du rein ischémique. À l’aide de la microscopie intravitale à 2 photons en série et de l’identification génétique des cellules cycliques, nous avons suivi simultanément et sur 3 semaines le remodelage dynamique des tissus dans les régions rénales post- et non ischémiques. L'analyse spatiale et temporelle des cellules cycliques par rapport à la mort cellulaire nécrotique initiale a démontré une propagation et une expansion prononcées des blessures dans des régions tissulaires non nécrotiques, ce qui prédisait une atrophie des tubules avec l'expression épithéliale de VCAM1. En résumé, nos analyses longitudinales des lésions tubulaires, du remodelage et du devenir fournissent des informations importantes sur la pathologie de l'AKI.
L’insuffisance rénale aiguë (IRA) est définie comme un déclin soudain de la fonction rénale, souvent provoqué par une lésion tubulaire aiguë1. Selon la gravité de l'agression, la fonction rénale des patients peut se rétablir. Cependant, il est désormais bien établi que les patients atteints d'IRA présentent un risque élevé de développer une maladie rénale chronique (IRC) plus tard2,3. Les mécanismes de cette transition AKI-CKD sont incomplètement compris3 mais associés à un dysfonctionnement des cellules endothéliales4,5, au recrutement et à l'inflammation des cellules immunitaires interstitielles6,7,8, à une fibrose interstitielle rénale9,10 et à une réparation épithéliale incomplète des tubules11,12. Le tubule proximal rénal (PT) est le principal site de lésion lors d'une lésion d'ischémie-reperfusion (IRI) et subit un remodelage important13. En cas de blessure, les cellules PT peuvent se dédifférencier avec l'expression de novo de marqueurs tels que Kim-1, Cd44 et la vimentine, proliférer et éventuellement se re-différencier en cellules PT fonctionnelles14,15,16. Néanmoins, dans leur état dédifférencié, ils s’engagent également dans les voies de signalisation paracrine renforçant l’inflammation interstitielle, le recrutement des myofibroblastes et le remodelage fibreux ultérieur14,17,18,19. Des études récentes de séquençage de cellules uniques obtenues à partir de reins IRI suggèrent en outre qu'un sous-ensemble de ces cellules PT dédifférenciées subissent un état d'échec de réparation avec une signalisation inflammatoire accrue8,11. Enfin, la mort cellulaire nécrotique induite par l’AKI peut directement contribuer à une inflammation accrue des tissus et à d’autres blessures20,21.
Pour prévenir la transition AKI-CKD, nous avons besoin de mieux comprendre comment les lésions tissulaires et les processus de remodelage sont liés à une guérison réussie ou infructueuse. Cependant, les données longitudinales disponibles pour étudier cette question sont limitées. Les biopsies des patients AKI ne sont pas systématiquement collectées et démontrent une hétérogénéité considérable en ce qui concerne le moment où les biopsies ont été effectuées22. De plus, les études animales sur l’AKI impliquent classiquement la collecte d’organes pour une analyse ex vivo plus approfondie. Ainsi, les processus de remodelage hautement dynamiques induits par l'AKI sont reconstruits à partir d'instantanés uniques acquis auprès de différents animaux et à différents moments. Cela limite la compréhension des interactions dynamiques cellule-cellule et de leur impact sur le devenir du néphron. En fait, plusieurs questions plutôt fondamentales sur la manière dont le tissu rénal peut se régénérer après une lésion restent sans réponse ou font l'objet de controverses : quelles cellules prolifèrent en réponse à une lésion tissulaire ? Quelle est la capacité de récupération du tissu rénal blessé ? Comment le tissu rénal non lésé est-il influencé par une lésion focale adjacente ? Les blessures peuvent-elles se propager avec le temps ?
Dans cette étude, nous avons combiné la microscopie intravitale en série à 2 photons (2PM) avec l'identification génétique des cellules en cycle23 et un modèle de lésion d'ischémie-reperfusion partielle (IRI partielle), qui a été conceptualisé pour étudier les effets des cellules nécrotiques sur les tissus adjacents non lésés. L'imagerie en série de reins IRI partiels sur 3 semaines a fourni des données appariées sur les lésions et le remodelage des tubules et, pour la première fois, a lié la mort cellulaire nécrotique initiale aux sites locaux de prolifération des tubules et finalement au devenir des tubules. Ainsi, nos données ont identifié le tubule proximal précoce comme un site clé de lésion nécrotique et une source de formation de plâtre granulaire, associée à la propagation des lésions en aval et au développement d'une atrophie tubulaire.
25 μm) from any propidium iodide (PI)+ cell detected on day 0 (n = 145, 184 and 37 segments from 4 mice for PT-S1, PT-S2, and DCT/CD, respectively); mean ± 95% CI with scatterplot. Statistical test: two-sided paired t-test with p < 0.05 considered significant (Supplementary Extended Statistics.k). d Same dataset as in (c) displayed to reveal distinct locations of proliferating tubule cells in different tubule segments over days after partial IRI (n = 4 partial IRI mice; detailed information on segment number/group provided in Supplementary Table 3); mean ± 95% CI with scatterplot. Statistical test: linear mixed-effect model, p-values from two-sided test (Supplementary Extended Statistics.m). e Volumetric quantification of tubular GFP expression (% of total nuclei/ segment) clustered by necrotic thresholds (n = 223, 140, 157 PT-S1 segments and 250, 237, 103 PT-S2 segments for non-necrotic, moderate, and severe, respectively, from 6 mice); mean ± 95% CI with scatterplots. Statistical test: linear mixed-effect model, p-values from two-sided test (Supplementary Extended Statistics.n). f Linear regression of PI+ nuclei (% of total nuclei/segment) at day 0 and cumulative GFP+ nuclei (% of total nuclei/ segment) from days 1, 2, and 3 for PT-S1 and PT-S2 segments (n = 144 and 180 from 4 mice). Fit (slope*x + intercept, plotted with 95% CI), R2 and Pearson’s coefficient (r) are reported for both. #: significant difference of slope and intercept from zero. *: significance test across groups, p-values from two-sided test. */#: p < 0.05; **/##: p < 0.01; ***/###: p < 0.001./p>20% necrotic cells at day 0). Consistent with the findings above, we observed significantly higher GFP expression in non-necrotic and moderately necrotic PT-S2 segments on days 2 and 3 as compared to respective PT-S1 (Fig. 4e). Among severely necrotic segments, PT-S1 segments proliferated more than PT-S2 segments on day 1. However, GFP expression in severely necrotic PT-S2 segments rapidly increased from day 2 and exceeded that observed in PT-S1 segments on days 3 and 7 (Fig. 4e). Finally, we aimed to evaluate if PT-S1 and PT-S2 displayed different capacities to proliferate upon necrotic cell death of a given degree. Thus, we performed a linear regression of PI-positive nuclei (% of total nuclei) observed on day 0 and the cumulative number of GFP-positive nuclei (% of total nuclei) observed on days 1 to 3 after partial IRI. For both PT-S1 and PT-S2 segments, a significant correlation between the initial number of necrotic cells and the subsequent proliferative response was detected (Fig. 4f). Of note, there was no significant difference in the slopes of the linear regressions, indicating a comparable necrosis-induced proliferative response in PT-S1 and PT-S2 segments (Fig. 4f). However, we detected a significantly higher intercept in the linear regression of PT-S2 segments (Fig. 4f), which demonstrated a population of PT-S2 segments that proliferated in absence of preceding necrotic injury. In contrast, the intercept of the PT-S1 linear regression equation was not statistically different from zero, confirming that proliferation in these segments strictly depended on the presence of initial necrotic injury./p>1% PI+ necrotic cells at day 0 was classified as necrotic; mean ± 95% CI with scatterplots. Statistical test: linear mixed-effect model, p-values from two-sided test, no adjustment for multiple comparisons (Supplementary Extended Statistics.o). e Linear regression of luminal granular cast area (% of total segment cross-sectional area) and GFP+ nuclei (% of total nuclei/ segment, assessed in 3D) measured 24 h later in the same segment and proliferating outside a 25 µm radius from any PI+ nucleus (n = 179 and 184 for non-necrotic and necrotic segments from 4 and 3 mice, respectively). Fit (slope*x + intercept, plotted with 95% CI); R2 and Pearson’s correlation coefficient (r) are reported for both. #: significant difference of slope and intercept from zero. *: significant difference between the segment types, p-values from two-sided test, */#: p < 0.05; **/##: p < 0.01; ***/###: p < 0.001./p>1% PI+) (c) and GFP+ nuclei (% of total nuclei/ segment) at day 3/4 (d), in recovered and atrophic tubule segments, respectively (c: n = 89 and 92 segments from 4 and 3 mice; d: n = 124 and 168 segments from 4 mice, respectively); mean ± 95% CI with scatterplot. Statistical tests: linear mixed-effect model, p-values from two-sided test (Supplementary Extended Statistics.q). e Correlative in vivo and ex vivo 2-photon microscopy images of CycB1-GFP kidneys 21 days after partial IRI reveal selective tubular VCAM-1 immunostaining (blue, arrows) in atrophic tubules (ω). Scale bar: 100 µm. f, g Tubular fate distribution (%) across partial IRI areas (f: n = 82,232, and 153 segments for Not-IR, Mid, and IR from 4, 6, and 5 mice, respectively), and days after partial-IRI (g: n = 103 and 106 for recovered and atrophic tubules from 6 mice, respectively). h Binary regression of luminal granular cast area (in % of total segment cross-sectional area) at day 3/4 and respective tubule fate (0 = non-atrophy; 1 = atrophy), (n = 237 segments from 4 mice, respectively). Fit (slope*x + intercept); R2, and effect size as odds ratio (OR) for the predictor are reported. *: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001./p>1% of total nuclei) that regained morphologically intact epithelium. Atrophic segments were defined by a collapsed tubular lumen and severely fragmented epithelial appearance (Supplementary Fig. 2). (9) Dynamic PT-S1 function was assessed as albumin reuptake capacity expressed as the mean fluorescent intensity ratio of Alexa594-albumin in the apical cytoplasmic region of PT-S1 segments and in peritubular capillaries (n = 170)./p>
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